In einer geheimen Forschungsanlage mit dem Namen Projekt Pegasus arbeitet die Organisation S.H.I.E.L.D. daran, den Tesserakt (siehe Captain America: The First Avenger) als eine unerschöpfliche Energiequelle einzusetzen. Allerdings ist der aus Asgard stammende Würfel auch ein interdimensionaler Portalöffner, und eine außerirdische Macht, die Chitauri, will damit die Erde erobern. Zu diesem Zweck haben sie ein Bündnis mit dem Asen Loki geschlossen, der die Geheimnisse des Würfels kennt (siehe Thor). Mit seinem Zepter öffnet Loki durch den Tesserakt ein Portal im Inneren von Projekt Pegasus, dringt in die Anlage ein und bringt nach kurzem Kampf einige Mitarbeiter des Projekts um Dr. Selvig und den S.H.I.E.L.D.-Spezialagenten Clint Barton (Hawkeye) durch Gedankenkontrolle in seine Gewalt. Mit deren Hilfe nimmt er den Tesserakt an sich und flüchtet aus der Anlage, die daraufhin durch das instabil gewordene Portal komplett zerstört wird.

Mithilfe seiner Agenten Phil Coulson und Black Widow beginnt Nick Fury, der Leiter von S.H.I.E.L.D., einige Superhelden zu rekrutieren, die ihm bei der Wiederbeschaffung des Tesserakts behilflich sein sollen: den brillanten Erfinder und Techno-Superhelden Tony Stark und den Experten für Gammastrahlung Dr. Bruce Banner. Zusammen mit Captain America versuchen sie in der Zentrale von S.H.I.E.L.D., einem flugfähigen Flugzeugträger namens Helicarrier, eine Spur des Tesserakts zu finden, der eine schwache Gammastrahlensignatur von sich gibt.

Kurze Zeit später taucht Loki zusammen mit Hawkeye in Stuttgart auf, um eine Probe Iridium zu stehlen. Die Superhelden stellen Loki, der sich überraschend schnell ergibt, und machen sich auf zum Helicarrier. Unterwegs werden sie von Thor abgefangen, der mit Odins Hilfe auf die Erde gekommen ist, um Loki und den Tesserakt wieder nach Asgard zurückzuholen. Nach einem Streit samt Schlagabtausch mit Iron Man bezüglich der Verantwortung über Loki schließt sich Thor den Superhelden an. Auf dem Helicarrier angekommen wird Loki in eine Spezialzelle gesperrt, doch er weigert sich, irgendwelche Informationen preiszugeben. Stark und Banner erkennen jedoch, dass Loki den Tesserakt zum Schaffen eines Portals benutzen will, wobei ihnen der eigentliche Zweck noch verborgen bleibt. Das gestohlene Iridium soll als Stabilisator dienen, damit das Portal nicht so instabil wird wie bei Projekt Pegasus.

Bald stellt sich Lokis Gefangennahme als Teil eines hinterlistigen Plans heraus. Während Hawkeye, der noch von Loki kontrolliert wird, mit einigen Helfern den Helicarrier infiltriert und eine Sabotage vorbereitet, gelingt es Loki mit seinen manipulativen Fähigkeiten, Zwistigkeiten zwischen den Superhelden zu entfachen. Diese haben inzwischen herausgefunden, dass Fury heimlich die Kräfte des Tesserakts nutzen wollte, um ein Arsenal von Superwaffen einzurichten, welche die Erde gegen eine drohende Invasion außerirdischer Kräfte wappnen sollten. Angestachelt von Lokis unheimlichem Einfluss bricht schließlich der Hulk in Dr. Banner aus und beginnt einen Amoklauf auf dem Schiff. Zur gleichen Zeit setzt Hawkeye zwei der Turbinen des Helicarriers außer Betrieb, der dadurch abzustürzen droht, und beschäftigt so Captain America und Iron Man, während Black Widow sich Hawkeye und Thor sich dem Hulk im Zweikampf stellen müssen. Zwar gelingt es Widow, Hawkeye K. o. zu schlagen und ihn dabei von der Gedankenkontrolle zu befreien, doch der Hulk geht beim Kampf über Bord. Loki bricht aus seiner Zelle aus, verwundet Coulson tödlich, schließt Thor in die Zelle ein und lässt ihn damit abstürzen, bevor er sich unbehelligt davonmacht.

Durch die Nachricht von Coulsons Tod schockiert, legen Captain America und Iron Man ihren Zwist beiseite, und die an Bord Verbliebenen beraten, was zu tun ist. Sie finden heraus, dass Loki das Portal auf dem neu errichteten Stark Tower in New York öffnen will – einerseits um seines Egos willen, andererseits um den im Gebäude befindlichen Arc-Reaktor (siehe Iron Man) als Energiequelle zu nutzen. Die Helden machen sich auf den Weg, kommen aber zu spät. Das Portal ist bereits geöffnet, und die Streitmacht der Chitauri beginnt ihren Angriff auf die Erde. Während die Superhelden den ersten Ansturm der Invasoren abwehren, stoßen auch Thor und der Hulk hinzu, die ihren Sturz zur Erde dank ihrer Kräfte heil überstanden haben. Als jedoch immer mehr feindliche Streitkräfte aus dem Portal strömen, entschließt sich der Sicherheitsrat, dem S.H.I.E.L.D. untersteht, trotz Furys Einspruch und ungeachtet der potenziellen Opfer, die Gefahr durch eine Nuklearrakete zu beseitigen. Von Fury alarmiert fängt Iron Man die Rakete im Flug ab und steuert sie durch das Portal, wo sie auf der anderen Seite das Mutterschiff der Chitauri zerstört und damit die Abschaltung ihrer Kampfeinheiten bewirkt. Mithilfe von Selvig, der von Lokis Kontrolle befreit wurde, schließt Black Widow das Portal, unmittelbar nachdem der bewusstlose Iron Man hin durchfällt und zur Erde stürzt, wo er vom Hulk aufgefangen wird. Loki muss sich den Avengers am Ende kleinlaut geschlagen geben.